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    色譜分析法基礎知識


    色譜法創始人茨維特植物學家


    色譜法的創始人是俄國的植物學家茨維特( M.Tswett)。

    1906年,俄國植物學家茨維特發表了他的實驗結果:為了分離植物色素,

    他將含有植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中,

    并用石油醚自上而下淋洗,由于不同的色素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不同,

    隨著淋洗的進行,不同色素向下移動的速度不同,從而形成一圈圈不同顏色的色帶,

    使各色素成分得到了分離。他將這種分離方法命名為色譜法(chromatography)。


    色譜法是非常重要又常用的分析方法,今天隨小Y補充基礎知識!


    植物葉色素的分離實驗

    茨維特實驗圖示


    √ 色譜柱—玻璃柱

    √ 固定相—CaCO3顆粒

    √ 流動相—石油醚  


    隨著分離手段的不斷發展,越來越多的無色物質成為被分離的對象,

    色譜也漸漸失去了“色”的含義,但這個名稱卻沿用至今。



    色譜分析法(Chromatography)簡稱色譜法或層析法,

    是一種物理或物理化學分離分析方法,該法利用某一特定的色譜系統

    (薄層色譜、高效液相色譜或氣相色譜等系統)進行混合物中各組分

    的分離分析,主要用于分析多組分樣品。

    ? 固定相:在色譜分離中固定不動,對樣品產生保留的一相。

    ? 流動相:帶動樣品向前移動的另一相。




    1624521331384771.jpg



    分類



    按兩相物理狀態分類

    ? 流動相:氣相色譜、液相色譜、超臨界流體色譜

    ? 固定相:氣-固、氣-液;液-固、液-液


    按固定相的形式分類

    ? 柱色譜:填充柱色譜、毛細管柱色譜、微填充柱色譜、制備色譜

    ? 平面色譜:紙色譜、薄層色譜、高分子膜色譜


    按分離機制分類

    ? 吸附色譜:根據不同組分在吸附劑上的吸附和解吸能力的大小而分離

    ? 分配色譜:根據不同組分在固定液中溶解度的大小而分離

    ? 分子排阻色譜:依據分子體積大小不同進行分離ln離子交換色譜:不同組分對離子交換樹脂的親和力不同而分離

    ? 親和色譜:利用生物大分子之間的存在的專一的特殊親和力進行分離

    ? 毛細管電泳:依據各組分淌度和(或)分配行為的差異進行分離

    ? 手性色譜:用于手性藥物的分離分析,可分為三類:手性衍生化試劑法;手性流動相添加劑法;手性固定相拆分法



    色譜分離的過程:

    微信圖片_20210624155837.jpg


    【色譜法的基本術語】


    檢測色譜分離后組分的響應信號對時間作圖得到的曲線稱為色譜圖。



    色譜圖,色譜流出曲線圖MSDS

    微信圖片_20210624155910.png


    由色譜峰的流出曲線可以實現以下目的:

    (1)依據色譜峰的保留值進行定性分析

    (2)依據色譜峰的面積或峰高進行定量分析

    (3)依據色譜峰的保留值以及峰寬評價色譜柱的分離效能



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    ? 基線:在一定色譜條件下,僅有流動相通過檢測器系統時所產生的信號的曲線,

    稱為基線,如圖中ot線。實驗條件穩定時,基線是一條平行于橫軸的線;

    基線反映儀器(主要是檢測器)的噪聲隨時間的變化。

    ? 峰高:色譜峰頂點與基線之間的垂直距離,以h表示,如圖AB’線。

    ? 區域寬度:色譜峰的區域寬度直接與分離效率有關。

    描述色譜峰寬的方法有三種:標準偏差σ、峰寬W、半峰寬W1/2。 

    ? 標準偏差(σ):σ為正態分布曲線上兩拐點間距離之半,

    σ值的大小表示組分離開色譜柱的分散程度。 σ值越大,流出的組分越分散,

    分離效果變差;反之,流出組分集中,分離效果好。

    ? 峰寬W:通過色譜峰兩側的拐點作切線,在基線上的截距稱為峰寬,

    或稱基線寬度,也可用W表示,如圖IJ的距離。根據正態分布的原理 ,

    可證得峰寬和標準差的關系是W=4σ。

    ? 半峰寬W1/2:峰高一半處的峰寬稱為半峰寬,如圖 GH 的距離。

     W1/2=2.355σ,W=1.699W1/2。

    W1/2、W都是由σ派生而來的,除用它們衡量柱效外,還用于計算峰面積。

    半峰寬測量較方便,Z為常用。


    【色譜保留值、相對保留值與保留指數】


    ? 保留值

    是用來描述樣品組分在色譜柱中保留程度的參數,并作為色譜定性的指標。其表示方法有:


    1624522318223484.jpg


    ? 相對保留值

    又稱分離因子、分配系數比或相對容量因子,即在一定色譜條件下,

    被測組分的調整保留時間(體積)與標準物的調整保留時間(體積)之比。


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    采用相對保留值是為了消除某些操作條件,如流速和固定液流失等,對保留值的影響。

    相對保留值中標準物可以是被測樣品中的某一組分,也可以是人為加入的某一化合物。


    ? 保留指數

    I為待測物質i在某固定液X上的保留指數,選取兩個正構烷烴作為基準物質,

    其中一個的碳數為N,另一個為N+n,它們的調整保留時間分別為t’R(N)和 t’R(N+n),

    使待測物質i的調整保留時間t’R(i)恰好于兩者之間,即t’R(N)<t’R(i)<t’R(N+n)。

    將含物質i和所選的兩個正構烷烴的混合物注入其固定液X的色譜柱,在一定溫度條件下繪制色譜圖。



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    保留指數的計算式為:


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    當相鄰兩個正構烷的碳數差值n=1時,保留指數或簡化為:


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    【容量因子與分配系數】

    1. 容量因子(k)

    在平衡狀態下,組分在固定相(s)與流動相(m)中的質量之比,稱為容量因子。公式如下: 


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    2. 分配系數(K)

    在平衡狀態下,組分在固定相(s)與流動相(m)中的濃度之比,稱為分配系數。公式如下:


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    ? K與k的關系:


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    ? 保留值與容量因子及分配系數的關系

    色譜分離是基于固定相對試樣中各組分的吸附或溶解能力強弱的不同,

    而這種吸附或溶解能力的強弱可定量地用分配系數K(或容量因子k)值的大小來表示。

    吸附或溶解能力強的組分分配系數(或容量因子)大,保留時間長;

    反之,吸附或溶解能力弱的組分分配系數小,保留時間短。



    基本理論

    主要包括塔板理論和速率理論。


    【塔板理論】

    1. 提出——熱力學理論

    ? 始于馬?。∕artin)和辛格(Synge)提出的塔板模型。

    ? 分餾塔:在塔板上多次氣液平衡,按沸點不同而分離。

    ? 色譜柱:組分在兩相間的多次分配平衡,按分配系數不同而分離。


    2. 假設

    (1)色譜柱內存在許多塔板,組分在塔板間隔(即塔板高度)內可以很快達到分配平衡。

    (2)流動相進入色譜柱,不是連續的而是脈動式的,即每次通過為一個塔板體積。

    (3)樣品加在每個塔板上,樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。

    (4)在所有塔板上分配系數相等,與組分的量無關。即分配系數在各塔坂上是常數。


    原理:


    塔板理論示意圖

    ? 開始時,若有單位質量,即m=1(例1mg或1μg)的某組分加到第0號塔板上,

    分配平衡后,由于k=1,即ns=nm故nm=ns=0.5。

    ? 當一個板體積(lΔV)的載氣以脈動形式進入0號板時,就將氣相中含有nm部分組分的

    載氣頂到1號板上,此時0號板液相中ns部分組分及1號板氣相中的nm部分組分,

    將各自在兩相間重新分配。故0號板上所含組分總量為0.5,

    其中氣液兩相各為0.25而1號板上所含總量同樣為0.5.氣液相亦各為0.25。

    ? 以后每當一個新的板體積載氣以脈動式進入色譜柱時,上述過程就重復一次(見下表)。


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    定量與定性分析



    (一)定性分析

    色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質在一定的色譜條件下均

    有確定的保留值,因此保留值可作為一種定性指標。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。


    但是不同物質在同一色譜條件下,可能具有相似或相同的保留值,即保留值并非專屬的。

    因此僅根據保留值對一個完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來源、性質、

    分析目的的基礎上,對樣品組成作初步的判斷,再結合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。


    1. 利用純物質對照定性

    在一定的色譜條件下,一個未知物只有一個確定的保留時間。因此將已知純物質在相同的色譜

    條件下的保留時間與未知物的保留時間進行比較,就可以定性鑒定未知物。若二者相同,

    則未知物可能是已知的純物質;不同,則未知物就不是該純物質。


    純物質對照法定性只適用于組分性質已有所了解,組成比較簡單,且有純物質的未知物。


    2. 相對保留值法

    在某一固定相及柱溫下,分別測出組分i和基準物質s的調整保留值,再按上式計算即可。

    用已求出的相對保留值與文獻相應值比較即可定性。


    3. 加入已知物增加峰高法

    當未知樣品中組分較多,所得色譜峰過密,用上述方法不易辨認時,

    或僅作未知樣品指定項目分析時均可用此法。


    首先作出未知樣品的色譜圖,然后在未知樣品加入某已知物,又得到一個色譜圖。

    峰高增加的組分即可能為這種已知物。


    4. 保留指數定性法

    保留指數表示物質在固定液上的保留行為,是目前GC中使用Z廣泛并被國際上公認的定性指標。

    它具有重現性好、標準統一及溫度系數小等優點。

    保留指數僅與固定相的性質、柱溫有關,與其它實驗條件無關。

    其準確度和重現性都很好。只要柱溫與固定相相同,就可應用文獻值進行鑒定,而不必用純物質相對照。


    待續……


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